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　Expression and reconstitution of functional membrane protein complexes by using baculovirus system
准教授
先浜 俊子
Associate Professor Toshiko SAKIHAMA
専門分野： 免疫学、分子生物学
研究内容： バキュロウイルス発現系を用いた機能的膜蛋白質の発現と抗体作製、蛋白質相互作用解析
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バキュロウイルス発現系を用いた機能的膜蛋白質の発現と抗体作製、蛋白質相互作用解析

　細胞膜に存在するいわゆる膜蛋白質は、細胞間相互作用や、細胞内のシグナル伝達に重要な機能を果たしている。しかしながら膜蛋白質は凝集しやすく、また正しい立体構造を取れないと全く機能しない。そのため、従来の大腸菌などを用いた発現法では生理的機能を保持した膜蛋白質の発現は困難であった。昆虫ウイルスであるバキュロウイルスに種々の膜蛋白質遺伝子を導入すると、感染細胞外に産生される発芽型ウイルス（ＢＶ）上に外来膜蛋白質が発現する。発芽型ウイルス上に発現した外来膜蛋白質は生理活性を保持している。更に複数の遺伝子を発現するウイルスを昆虫細胞に共感染させることにより、機能的な蛋白質複合体をＢＶ上に再構成することができる。このシステム（バキュロウイルスディスプレイ法）を用いて、以下の研究を行っている。

（１） 細胞間相互作用と機能制御に関わる膜蛋白質の研究

　免疫系においては、Ｔリンパ球と樹状細胞、Ｂリンパ球などの抗原提示細胞との細胞間相互作用が重要な役割を果たしている。細胞間相互作用の実体は、多様な細胞膜表面蛋白質の相互作用であり（図１）、その結果として細胞内にシグナルが伝達される。
　多くの場合、免疫細胞の膜蛋白質の生理的リガンドに対する親和性は低く、細胞膜上で会合してmultimerを形成することにより、はじめて生理活性発現に必要な高avidityの相互作用が可能になると考えられている。可溶性の単量体の形で膜蛋白質を発現させた場合には、この細胞膜上でのmultimer形成を再現することは不可能である。バキュロウイルスディスプレイ法は、融合蛋白にすると機能を失う蛋白質や、heterodimer, heterotrimerのような複合体として活性を発現する蛋白質もintactな形でウイルス粒子上に発現させることが可能である点で優れたシステムである。また、発現した膜蛋白質は、ウイルス上でmultimerを形成できることが期待される。
　すでにいくつかの免疫細胞膜蛋白質を発現する組み換えバキュロウイルスを作製して、膜蛋白質発現ＢＶとその生理的リガンド発現細胞との間の特異的な相互作用の検出に成功している。このような機能的膜蛋白質発現ウイルスをツールとして、免疫系細胞の細胞間相互作用と機能制御に関わる膜蛋白質間相互作用の解析、及びその相互作用をモジュレートするシステムの開発を行いたいと考えている。

（２） 宿主免疫能の制御による抗体作製技術の改良

　現在、浜窪教授、望月助教授と協同して、様々な膜蛋白質を発現するＢＶを直接マウスに免疫し，膜蛋白質に対する機能性抗体の作製を行っている。この際に、免疫細胞の機能をポジティブに制御する膜蛋白質を発現するＢＶを目的抗原膜蛋白質発現ＢＶと共にマウスに投与して、抗体の親和性成熟の増強や免疫抑制の解除を誘導することにより、従来、抗体作製が困難であった抗原蛋白質に対しても効率良く高親和性の抗体を作製する技術の開発を行っている。

 

図１．膜蛋白質を介するＴ細胞・抗原提示細胞（ＡＰＣ）の相互作用

図２．バキュロウイルスディスプレイ系による膜蛋白質間相互作用の検出

Pickup publications

Tregが移植臓器片に対する拒絶反応を抑制できる

　制御性Ｔ(Treg)はCD4+CD25+のフェノタイプを示す特殊なＴ細胞であり、生体内では自己に対する免疫反応を抑制して自己免疫病の発症を防いでいる。
　 本論文ではTregが移植臓器片に対する拒絶反応も抑制できること、及び、in vitroで移植抗原特異的なTregを増幅できることを確認し、臓器移植での拒絶反応の抑制への応用の可能性を示した。

原著論文
Nishimura E., Sakihama T., Setoguchi R., Tanaka K., Sakaguchi S.
Induction of antigen-specific immunologic tolerance by in vivo and in vitro antigen-specific expansion of naturally arising Foxp3+CD25+CD4+ regulatory T cells.
Int. Immunol. 8: 1189-1201, 2004.

CD4とclass II MHCの相互作用がヘルパーＴ細胞の成熟・分化に必須である

　CD4の細胞外ドメインのアミノ酸残基Phe43は、変異体を用いたin vitroでの解析およびX線結晶構造解析より、リガンドclass II MHCとの相互作用に必須であることが報告されてきた。
　 本論文は、Phe43残基を変異させたCD4変異体のみを発現するノックインマウスでは胸腺でのCD4陽性細胞の成熟が阻害されることを確認し、 Phe43残基を含む領域を介したCD4とclass II MHCの相互作用がヘルパーＴ細胞の成熟・分化に必須であることを示した。

原著論文
Sakihama T, Hunsicker ME, Hussey RE, Reinherz EL.
Human CD4 residue Phe 43 is critical for repertoire development and maturation of class II MHC-restricted CD4 single positive T lineage cells in vivo.
Eur J Immunol. 30: 279-290, 2000.

Tリンパ球上の膜蛋白質CD4は細胞膜上で会合してホモオリゴマーを形成することで活性化する

　Tリンパ球上の膜蛋白質CD4はリガンドである抗原提示細胞上のclass II MHCとの相互作用を介してヘルパーT細胞の分化・機能発現に重要な役割を果たしている。
　 本論文は、可溶型単量体として発現させた場合にはclass II MHCに対して非常に低い親和性しか示さないCD4が、細胞膜上で会合してホモオリゴマーを形成することにより、生理活性発現に必要な高親和性の相互作用を行う可能性を示した。

原著論文
Sakihama T, Smolyar A, Reinherz EL.
Oligomerization of CD4 is required for stable binding to class II major histocompatibility complex proteins but not for interaction with human immunodeficiency virus gp120.
Proc Natl Acad Sci USA. 92:6444-6448, 1995

原著論文

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総説

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