Staff

分子生物医学／蛋白複合体

准教授
先浜 俊子
Associate Professor Toshiko SAKIHAMA
専門分野： 免疫学、分子生物学
研究内容： バキュロウイルス発現系を用いた機能的膜蛋白質の発現と抗体作製、蛋白質相互作用解析

機能的な膜蛋白質の発現と蛋白質相互作用の研究

Expression of functional membrane protein complexes and detection of protein-protein interaction by using baculoviral display system

細胞間相互作用と機能制御に関わる膜蛋白質




細胞膜に存在する膜蛋白質は、細胞間相互作用や、細胞内のシグナル伝達に重要な機能を果たしている。しかしながら膜蛋白質は凝集しやすく、また正しい立体構造を取れないと全く機能しない。そのため、従来の大腸菌などを用いた発現法では生理的機能を保持した膜蛋白質の発現は困難であった。

昆虫ウイルスであるバキュロウイルスに種々の膜蛋白質遺伝子を導入すると、感染細胞外に産生される発芽型ウイルス粒子（ＢＶ）上に外来膜蛋白質が発現する。ＢＶ上に発現した外来膜蛋白質は生理活性を保持している。このシステム（バキュロウイルスディスプレイ法）を用いて研究を行っている。

免疫系は、微生物の感染などから生体を守るために備わっている重要なシステムである。免疫系においては、Ｔリンパ球と抗原提示細胞との細胞間相互作用が重要な役割を果たしている。細胞間では、多様な細胞表面の膜蛋白質同士が相互作用しており（図１）、その結果として細胞内にシグナルが伝達される。

多くの場合、免疫細胞の膜蛋白質同士の相互作用の親和性は低く、細胞膜上で会合して多量体を形成することにより、はじめて生理活性発現に必要な高親和性の相互作用が可能になると考えられている。可溶性の単量体の形で膜蛋白質を発現させた場合には、この細胞膜上での多量体形成を再現することは不可能である。

バキュロウイルスディスプレイ法は、融合蛋白にすると機能を失う蛋白質や、複合体として活性を発現する蛋白質も生理的な形でウイルス粒子上に発現させることが可能である点で優れたシステムである。また、発現した膜蛋白質は、ウイルス粒子上で多量体を形成できることが期待される。

すでにいくつかの免疫細胞膜蛋白質を発現する組み換えバキュロウイルスを作製して、膜蛋白質発現バキュロウイルス粒子とその生理的受容体発現細胞との間の特異的な相互作用の検出に成功している（図2～4）。このような機能的膜蛋白質発現バキュロウイルスをツールとして、膜蛋白質の新規の受容体の探索や、免疫機能を制御する抗体、薬剤のスクリーニング系の開発を行いたいと考えている。

Sellected papers

Sakihama T, Sato T, Iwanari H, Kitamura T, Sakaguchi S, Kodama T., Hamakubo T.
A Simple detection method for low-affinity membrane protein interactions by baculoviral display. PLoS ONE 3(12): e4024, 2008.

バキュロウイルスディスプレイ系を用いて、免疫細胞に発現する膜蛋白質間の相互作用検出系の構築を行った。リガンド・受容体の関係にある２種類の膜蛋白質を各々ディスプレイするバキュロウイルス粒子（BV）を調製し、２種類のBV間の特異的な相互作用をELISA法で検出した。同また、リガンド膜蛋白質をディスプレイするBVと抗BV抗体をツールとしたフローサイトメトリーにより、受容体発現細胞を検出することができた。更に膜蛋白質CD58ディスプレイBVと抗BV抗体を用いた磁気ビーズソーティングにより、発現cDNAライブラリーからCD2 (CD58受容体) cDNAのクローニングに成功した。このシステムは、ブロッキング抗体や化合物のスクリーニング系、リガンド探索への応用が期待される。

Sakihama T., Masuda K., Sato T., Doi T., Kodama T., Hamakubo T.
Functional reconstitution of G-protein-coupled receptor-mediated adenylyl cyclase activation by a baculoviral co-display system. J. Biotechnol. 135, 28-33, 2008.

バキュロウイルスに機能的な膜蛋白質をディスプレイさせるシステムを用いて、G蛋白質共役型受容体(GPCR)によるリガンド依存性シグナル検出系の開発を行い、GPCR、G蛋白質、アデニル酸シクラーゼの機能的な共役反応のウイルス粒子上での再構成に成功した。バキュロウイルスは内在性のGPCRを持たないため、このBV共ディスプレイ系は、動物細胞を用いた従来のアッセイ系に比べてバックグラウンドが低く、GPCRのリガンドスクリーニング系に有用であると期待される。

Nishimura E., Sakihama T., Setoguchi R., Tanaka K., Sakaguchi S.
Induction of antigen-specific immunologic tolerance by in vivo and in vitro antigen-specific expansion of naturally arising Foxp3+CD25+CD4+ regulatory T cells. Int. Immunol. 8: 1189-1201, 2004.

制御性Ｔ(Treg)はCD4+CD25+のフェノタイプを示す特殊なＴ細胞であり、生体内では自己に対する免疫反応を抑制して自己免疫病の発症を防いでいる。本論文ではTregが移植臓器片に対する拒絶反応も抑制できること、及び、in vitroで移植抗原特異的なTregを増幅できることを確認し、臓器移植での拒絶反応の抑制への応用の可能性を示した。

原著論文

  1. Sakihama T, Sato T, Iwanari H, Kitamura T, Sakaguchi S, Kodama T., Hamakubo T. A Simple detection method for low-affinity membrane protein interactions by baculoviral display. PLoS ONE 3(12): e4024, 2008
  2. Sakihama T., Masuda K., Sato T., Doi T., Kodama T., Hamakubo T. Functional reconstitution of G-protein-coupled receptor-mediated adenylyl cyclase activation by a baculoviral co-display system. J. Biotechnol. 135, 28-33, 2008.
  3. Saitoh R., Ohtomo T., Yamada Y., Kamada N., Nezu J., Kimura N., Funahashi S., Furugaki K., Yoshino T., Kawase Y., Kato A., Ueda O., Jishage K., Suzuki M., Fukuda R., Arai M., Iwanari H., Takahashi K., Sakihama T., Ohizumi I., Kodama T., Tsuchiya M., Hamakubo T. Viral envelope protein gp64 transgenic mouse facilitates the generation of monoclonal antibodies against exogenous membrane proteins displayed on baculovirus. J. Immunol. Methods 322, 104-117, 2007.
  4. Yoshitomi H., Sakaguchi N., Kobayashi K., Brown G.D., Tagami T., Sakihama T., Hirota K., Tanaka S., Nomura T., Miki I., Gordon S., Akira S., Nakamura T., Sakaguchi S. A role for fungal β-glucans and their receptor Dectin-1 In the induction of autoimmune arthritis in genetically susuceptible mice. J. Exp. Med. 201:949-960, 2005.
  5. Tachibana M, Ueda J, Fukuda M, Takeda N, Ohta T, Iwanari H, Sakihama T, Kodama T, Hamakubo T, Shinkai Y. Histone methyltransferases G9a and GLP form heteromeric complexes and are both crucial for methylation of euchromatin at H3-K9. Genes Dev. 19: 815-26, 2005.
  6. Nishimura E., Sakihama T., Setoguchi R., Tanaka K., Sakaguchi S. Induction of antigen-specific immunologic tolerance by in vivo and in vitro antigen-specific expansion of naturally arising Foxp3+CD25+CD4+ regulatory T cells. Int. Immunol. 8: 1189-1201, 2004.
  7. Matsui Y., Saiura A., Sugawara Y., Sata M., Naruse K., Yagita H., Kohro T., Mataki C., Izumi A., Yamaguchi T., Minami T., Sakihama .T, Ihara.S., Aburatani H., Hamakubo .T, Kodama T., Makuuchi M. Identification of gene expression profile in tolerizing murine cardiac allograft by costimulatory blockade. Physiol. Genomics. 15:199-208, 2003.
  8. Sakaguchi N., Takahashi T., Hata H., Nomura T., Tagami T., Yamazaki S., Sakihama T., Matsutani T., Negishi I., Nakatsuru S., Sakaguchi S. Altered thymic T-cell selection due to a mutation of the ZAP-70 gene causes autoimmune arthritis in mice. Nature. 426: 454-460, 2003.
  9. Masuda K., Itoh H., Sakihama T., Akiyama C., Takahashi K., Fukuda R., Yokomizo T., Shimizu T., Kodama T., and Hamakubo T. A Combinatorial G Protein-coupled Receptor Reconstitution System on Budded Baculovirus. J. Biol. Chem. 278: 24552-24562, 2003.
  10. Wang J-H, Meijers R, Xiong Y, Liu J-H, Sakihama T, Zhang R, Joachimak A, Reinherz EL. Crystal structure of the human CD4 N-terminal two-domain fragment complexed to a class II MHC molecule. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 10799-10804, 2001.
  11. Sakihama T, Hunsicker ME, Hussey RE, Reinherz EL. Human CD4 residue Phe 43 is critical for repertoire development and maturation of class II MHC-restricted CD4 single positive T lineage cells in vivo. Eur. J. Immunol. 30: 279-290, 2000.
  12. Yoshikawa H, Sakihama T, Nakajima Y, Tasaka K. Fc gammaRIII-mediated regulation of hematopoiesis in murine bone marrow cells by interleukin-3 and CD95 (Fas/Apo-1). Blood 90:1911-1919, 1997.
  13. Yoshikawa H, Sakihama T, Nakajima Y, Tasaka K. Costimulation of fibronectin receptor promotes Fc gamma R-mediated rescue of IL-3-dependent bone marrow-derived cells from apoptosis. J. Immunol. 156:1832-1840, 1996.
  14. Kimura N, Yoshikawa H, Iwamoto M, Sakihama　T, Akasu F, Izui S, Ueno A, Nakajima Y, Tasaka K. cDNA sequence analysis and characterization of a cytokine-inducing monoclonal antibody derived from autoimmune MRL/MP-lpr/lpr mouse. Hybridoma. 14:523-528, 1995.
  15. Sakihama T, Smolyar A, Reinherz EL. Oligomerization of CD4 is required for stable binding to class II major histocompatibility complex proteins but not for interaction with human immunodeficiency virus gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:6444-6448, 1995.
  16. Naganuma H, Sasaki A, Satoh E, Sakihama T, Tasaka K, Nukui H. Improved bioassay for the detection of transforming growth factor-beta 1 and beta 2 in malignant gliomas. Neurol Med Chir (Tokyo). 34:143-149, 1994.
  17. Sakihama T, Shirakura-Shibata Y, Akasu F, Iwamoto M, Izui S, Nakajima Y, Tasaka K. An autoimmune MRL/Mp-lpr/lpr mouse-derived monoclonal IgG antibody stimulates cytokine production in bone marrow-derived cell line by crosslinking of a cell surface antigen and Fc receptor. Autoimmunity. 17:13-21, 1994.
  18. Hada M, Sakihama T, Kamiya K, Tasaka K, Ueno A. Cellular and humoral immune responses to vascular components in thromboangiitis obliterans. Angiology. 44:533-540, 1993.
  19. Sato E, Iwamoto M, Sakihama T, Yokoyama Y, Hamada Y, Matsuzawa A, Akamatsu N, Nakajima Y, Tasaka K. Serum IgG from CBA/KlJms-lprcg/lprcg mice induces interleukin 3 in an interleukin 3-dependent cell line: possible correlation with lymphadenopathy. Cell. Immunol. 138:372-380, 1991.
  20. Inoue S, Iimuro Y, Yamamoto M, Matsumoto Y, Sakihama T, Tasaka K. Analysis of mechanism of lung edema in E. coli injected septic rat model: in relation to tumor necrosis factor (TNF) produced from liver, spleen, and alveolar macrophages. Nippon Geka Gakkai Zasshi. 92:913-920, 1991. (Japanese).
  21. Iwamoto M, Sakihama T, Kimura N, Tasaka K, Onaya T. Augmented interleukin 6 production by rat thyrocytes (FRTL5): effect of interleukin 1 beta and thyroid-stimulating hormone. Cytokine. 3:345-349, 1991.
  22. Sakihama T, Iwamoto M, Akasu F, Takahashi S, Nakajima Y, Tasaka K. Monoclonal IgGs from an autoimmune MRL/Mp-lpr/lpr mouse induce an interleukin 3-dependent myeloid cell line to produce tumor necrosis factor α and interleukin 6. Cell. Immunol. 132:1-9, 1991.
  23. Iwamoto M, Akasu F, Sakihama T, Onaya T, Nakajima Y, Tasaka K. Serum IgG from an autoimmune prone mouse C3H/HeJ-gld/gld supports the interleukin-3-dependent cell line through an autocrine mechanism. Cell. Immunol. 125:151-159, 1990.
  24. Sakihama T, Akasu F, Iwamoto M, Shirakura-Shibata Y, Okada Y, Nakajima Y, Tasaka K. Polyclonal and monoclonal IgGs from MRL/Mp-lpr/lpr mice induce an interleukin 3-dependent cell line to produce interleukin 3 through Fcγ-receptor-mediated mechanism. Cell. Immunol. 125:160-170, 1990.
  25. Tasaka K, Sakihama T, Shirakura-Shibata Y, Matsuda S, Nakajima Y. Proliferative activity of autoimmune MRL mouse serum IgG to interleukin 3-dependent cell line through autocrine mechanism. Cell. Immunol. 121:317-327, 1989.
  26. Takano E, Maki M, Hatanaka M, Mori H, Zenita K, Sakihama T, Kannagi R, Marti T, Titani K, Murachi T. Evidence for the repetitive domain structure of pig calpastatin as demonstrated by cloning of complementary DNA. FEBS Lett. 208:199-202, 1986.
  27. Sakihama T, Kakidani H, Zenita K, Yumoto N, Kikuchi T, Sasaki T, Kannagi R, Nakanishi S, Ohmori M, Takio K, Titani K, Murachi T. A putative Ca2+-binding protein: structure of the light subunit of porcine calpain elucidated by molecular cloning and protein sequence analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:6075-6079, 1985.

    28. 総説

  28. Sakihama T, Smolyar A, Reinherz EL. Molecular recognition of antigen involves lattice formation between CD4, MHC class II and TCR molecules. Immunol Today. 16:581-587, 1995.